Біохімія 1
План
1. Третинна структура білкових молекул, її різновиди; значення для реалізації біологічних функцій білків
2. Методи визначення активності ферментів. Знати основні принципи кількісного визначення ферментів
3. Молекулярна організація мітохондріального ланцюга біологічного окислення: компоненти ланцюга, їх редокс-потенціали
4. Окислення вищих жирних кислот ( -окислення); роль карні тину в транспорті жирних кислот в мітохондрії. Енергетика -окислення жирних кислот
5. Задача
2. Методи визначення активності ферментів. Знати основні принципи кількісного визначення ферментів
Ферменти (ензими) — біологічні каталізатори білкової природи, які синтезуються в клітинах живих організмів та забезпечують необхідні швидкість і координацію біохімічних реакцій, що становлять обмін речовин (метаболізм).
Розділ біохімії, що вивчає структуру, властивості та механізми дії ферментів, називається ензимологією. Прийняті в ензимології позначення:
Е — фермент, ензим ("enzyme"; англ.) — біологічний каталізатор;
S— субстрат ("substrate"; англ.) — хімічна речовина, сполука, перетворення якої каталізує фермент;
Р — продукт ("product"; англ.) — сполука, що утворилася в результаті ферментативної реакції.
Ферменти — специфічні білки, в основі каталітичної дії яких лежать загальні фізико-хімічні та термодинамічні закономірності хімічної кінетики. Білкову природу ферментів беззаперечно довів Дж. Самнер (1926), який отримав перші кристалічні препарати ферменту уреази.
Властивості ферментів
– ферменти значно підвищують швидкість перебігу біохімічних реакцій, але не входять до складу кінцевих продуктів реакції;
– ферменти забезпечують перебіг лише тих біохімічних реакцій, які можливі, виходячи із законів термодинаміки;
– ферменти прискорюють швидкість як прямої, так і зворотної реакції перетворення субстрату, не змінюючи константи рівноваги (К) реакції та зменшуючи термін часу до досягнення стану рівноваги (або стаціонарного стану у відкритій метаболічній системі);
– протягом реакції фермент певним чином взаємодіє із субстратом, що перетворюється, але до складу кінцевих продуктів реакції не входить. Під час перебігу біохімічної реакції, що каталізується, відбувається циклічний процес, в ході якого фермент та субстрат підлягають ступеневому перетворенню з утворенням продукту реакції та регенерацією ферменту;
- ферменти євисокоспецифічними каталізаторами, тобто діють, як правило, на структурно близькі субстрати, що мають певний хімічний зв'язок, структурно подібні радикали або функціональні групи. Проявом високої специфічності ферментів єїх стереоспецифічність, тобто здатність перетворювати тільки певні стереоізомери, наприклад L- або D-амінокислоти, D- або L-моносахариди;
- відповідно до білкової природи, каталітична активність ферментів дуже чутлива до змін фізико-хімічних властивостей середовища (рН, температури), які можуть впливати на структурну організацію молекул ферментів, спричиняючи в певних умовах їх денатурацію;
- активність ферментів може суттєво змінюватися під впливом певних хімічних сполук, що збільшують (активатори) або зменшують (інгібітори) швидкість реакції, яка каталізується.
Оскільки кількість ферменту в біологічному об'єкті в більшості випадків визначити неможливо, для характеристики швидкості біохімічної реакції, що каталізується певним ферментом, за умов сталості інших показників середовища (фізико-хімічних параметрів, концентрації активаторів та інгібіторів) користуються значеннями активності ферменту.
Одиниці активності ферментів — умовні величини, що базуються на лінійній залежності швидкості ферментативної реакції від кількості ферменту (або кількості його молекул, що перебувають у каталітичне активному стані).
1. У біохімічній практиці загальноприйнятими є одиниці ферменту. Одиницею ферменту (U— unit; англ.) є така його кількість, яка каталізує перетворення 1 мкмоля субстрату за 1 хв:
1 U= 1 мкмоль/хв.
2. При використанні одиниць системи СІ (SI) активність ферменту виражають в каталах (кат).
1 катал — така кількість ферменту, яка каталізує перетворення 1 моля субстрату за 1 с:
1 кат = 1 моль/с.
3. Розповсюдженою одиницею є питома активність ферменту, яка визначається кількістю одиниць ферментної активності, що припадають на 1 мг білка в біологічному об'єкті (U/мг білка).
У медичній ензимології активність ферменту часто виражають в одиницях (U) на 1 л біологічної рідини, що досліджується, — сироватки крові, слини, сечі тощо (U/л).
3. Молекулярна організація мітохондріального ланцюга біологічного окислення: компоненти ланцюга, їх редокс-потенціали
Система біологічного окислення, що локалізована в мембранах мітохондрій, здійснює дегідрування органічних субстратів та послідовний перенос відновлювальних еквівалентів на кисень через ряд проміжних переносників — транспортерів електронів та протонів. Ця система організована у вигляді ланцюга електронного транспорту, або дихального ланцюга мітохондрій.
Дихальний ланцюг мітохондрій — сукупність молекулярних компонентів (ферментів та коферментів), які вбудовані в ліпідний матрикс внутрішніх мітохондріальних мембран і здійснюють окислення біологічних субстратів та послідовне, ступеневе транспортування відновлювальних еквівалентів на кисень з утворенням молекули води.
Компоненти дихального ланцюга мітохондрій:
НАДН-дегідрогеназа — компонент дихального ланцюга, що окислює відновлений НАД+ (НАДН); входить до складу молекулярного комплексу внутрішніх мітохондріальних мембран НАДН-коензим Q-реоуктази.
Сукцинатдегідрогеназа — компонент дихального ланцюга, що окислює янтарну кислоту; входить до складу молекулярного комплексу сукцинат-коензим Q-редуктази.
Коензим Q(убіхінон) — ліпідорозчинний хінон з ізопреноїдним бічним ланцюгом, що містить у тканинах ссавців десять п'ятивуглецевих ізопреноїдних залишків (Q10). Убіхінон виконує функцію колектора відновлювальних еквівалентів, акцентуючи протони та електрони не тільки від ФМН-залежної НАДН-дегідрогенази, а й від ФАД-залежних дегідрогеназ мітохондрій (сукцинатдегідрогенази та дегідрогеназ системи (3-окислення жирних кислот тощо).
Цитохроми мітохондрій: Цитохром Ь. Цитохром сг Цитохром с. Цитохром а. Цитохром а3.
Залізо-сіркові білки, що містять негемове залізо (FeS),—це білки, асоційовані з флавопротеїнами мітохондрій (металофлавопротеїнами) та цитохромом b.
Послідовність передавання електронів від одного компонента дихального ланцюга мітохондрій до іншого визначається стандартними окислювально-відновлювальними потенціалами цих компонентів —табл.1.
Таблиця 1. Стандартні окислювально-відновлювальні потенціали компонентів дихального ланцюга мітохондрій
Окислювально-відновлювальна пара п | E0',e |
НАДН/НАД+ | -0,32 |
Лактат / піруват | -0,19 |
Сукцинат / фумарат | + 0,03 |
Убіхінол /убіхінон | + 0,10 |
Цитохром b (Fe2+ / Fe3+) | + 0,12 |
Цитохром сі (Fe2+ / Fe3+) | + 0,21 |
Цитохром с (Fe2+ / Fe3+) | + 0,25 |
Цитохром a (Fe2+ / Fe3+) | + 0,29 |
Цитохром аз (Fe2+ /Fe3+) | + 0,55 |
H2O / 1/2O2 | + 0,82 |
Окремі ферменти та коферменти, що складають дихальний ланцюг, структурно об'єднані між собою в надмолекулярні (мультиензимні) комплекси, інтегровані в ліпідний матрикс внутрішніх мембран мітохондрій, що створює стеричні умови, необхідні для ефективного перебігу окислювально-відновлювальних реакцій.
Комплекси дихального ланцюга внутрішніх мембран мітохондрій
НАДН-коензим Q-редуктаза — ферментний комплекс (являє собою флаво-протеїн, що містить ФМН), який окислює НАДН і передає відновлювальні еквіваленти на коензим Q(убіхінон); у складі НАДН-коензим Q-редуктази НАДН-дегідрогеназа асоційована з FeS-білками (так званий комплекс І).
Сукцинат-коензим Q-редуктаза — ферментний комплекс (ФАД-залежний флавопротеїн), який окислює сукцинат, відновлюючи коензим Q; до складу комплексу входить флавопротеїн сукцинатдегідрогеназа, асоційована з FeS-білком (комплекс II).
Коензим Q-цитохром с-редуктаза (убіхінолдегідрогеназа) — ферментний комплекс, що складається з цитохрому b, FeS-білка та цитохрому с1;ферментний комплекс транспортує електрони з відновленого коензиму Q(QH2) на цитохром с (комплекс III).
Цитохром с-оксидаза — ферментний комплекс, що складається з цитохромів а та а3 (комплекс IV); комплекс здійснює кінцеву стадію біологічного окислення — відновлення електронами молекулярного кисню; він містить іони міді, як і інші оксид ази.
Шляхи включення відновлювальних еквівалентів у дихальний ланцюг мітохондрій
1. Включення протонів і електронів у дихальний ланцюг через ФМН флавопротеїну НАДН-коензим Q-редуктази. Цим шляхом на молекулу убіхінону надходять відновлювальні еквіваленти, відщеплені від відповідних субстратів НАДН-залежними дегідрогеназами.
2. Включення протонів і електронів у дихальний ланцюг через ФАД сукцинат-коензим Q-редуктази та деяких інших ФАД-залежних дегідрогеназ. Цим шляхом на убіхінон надходять відновлювальні еквіваленти від янтарної кислоти -метаболіту циклу трикарбонових кислот та певних інших субстратів.
Послідовність включення окремих компонентів системи транспорту електронів і протонів у дихальний ланцюг мітохондрій подано на рисунку 1.
Як випливає з наведеної схеми, дихальний ланцюг мітохондрій організований таким чином, що перенос у ньому відновлювальних еквівалентів (електронів) відбувається в напрямку від електронегативного кінця (флавопротеїнів) до електропозитивного цитохрому ау Більшість метаболітів (субстрати гліколізу, циклу трикарбонових кислот тощо) передає атоми водню в дихальний ланцюг через НАДН-дегідрогеназу (Е-ФМН); сукцинат та КоА-похідні жирних кислот віддають електрони та протони на коензим Qчерез специфічні флавопротеїни (Е-ФАД), минаючи ФМН-залежний флавопротеїн.
Убіхінон є останнім компонентом дихального ланцюга мітохондрій, що здатний транспортувати як електрони, так і протони. На рівні цитохрому bшляхи електронів і протонів розділяються — протони переходять з внутрішньої поверхні мітохондріальної мембрани на зовнішню, а електрони через послідовність цитохромів транспортуються на цитохром ау який відновлює кисень:
Взаємодія відновленого кисню з вільними протонами мітохондріального матриксу призводить до утворення молекули води:
Рис. 1. Схема організації дихального ланцюга мітохондрій. 1-IV– електронетранспортні комплекси мітохондріальних мембран.
Позначення: -КГ – -кетоглутарат; -ГО-ацил-КоА — -гідроксиацил-КоА; Гл-З-Ф — гліцерол-3-фосфат.