2. Методи визначення активності ферментів. Знати основні принципи кількісного визначення ферментів

Ферменти (ензими) — біологічні каталізатори білкової природи, які синте­зуються в клітинах живих організмів та забезпечують необхідні швидкість і координацію біохімічних реакцій, що становлять обмін речовин (метаболізм).

Розділ біохімії, що вивчає структуру, властивості та механізми дії ферментів, називається ензимологією. Прийняті в ензимології позначення:

Е — фермент, ензим ("enzyme"; англ.) — біологічний каталізатор;

S— субстрат ("substrate"; англ.) — хімічна речовина, сполука, перетворення якої каталізує фермент;

Р — продукт ("product"; англ.) — сполука, що утворилася в результаті фермен­тативної реакції.

Ферменти — специфічні білки, в основі каталітичної дії яких лежать загальні фізико-хімічні та термодинамічні за­кономірності хімічної кінетики. Білкову природу ферментів беззаперечно довів Дж. Самнер (1926), який отримав перші кристалічні препарати ферменту уреази.

Властивості ферментів

– ферменти значно підвищують швидкість перебігу біохі­мічних реакцій, але не входять до складу кінцевих продуктів реакції;

– ферменти забезпечують перебіг лише тих біохімічних реакцій, які можливі, виходячи із законів термодинаміки;

– ферменти прискорюють швидкість як прямої, так і зво­ротної реакції перетворення субстрату, не змінюючи конс­танти рівноваги (К) реакції та зменшуючи термін часу до досягнення стану рівноваги (або стаціонарного стану у від­критій метаболічній системі);

– протягом реакції фермент певним чином взаємодіє із субстратом, що перетворюється, але до складу кінцевих продуктів реакції не входить. Під час перебігу біохімічної реакції, що каталізується, відбувається циклічний процес, в ході якого фермент та субстрат підлягають ступеневому перетворенню з утворенням продукту реакції та регене­рацією ферменту;

- ферменти євисокоспецифічними каталізаторами, тобто діють, як правило, на структурно близькі субстра­ти, що мають певний хімічний зв'язок, структурно подібні радикали або функціональні групи. Проявом високої специфічності ферментів єїх стереоспецифічність, тобто здатність перетворювати тільки певні стереоізо­мери, наприклад L- або D-амінокислоти, D- або L-моносахариди;

- відповідно до білкової природи, каталітична активність ферментів дуже чутлива до змін фізико-хімічних властивостей середовища (рН, температури), які можуть впливати на структурну організацію молекул ферментів, спричиняючи в певних умовах їх денатурацію;

- активність ферментів може суттєво змінюватися під впливом певних хімічних сполук, що збільшують (активатори) або зменшують (інгібітори) швидкість реакції, яка каталізується.

Оскільки кількість ферменту в біологічному об'єкті в більшості випадків визна­чити неможливо, для характеристики швидкості біохімічної реакції, що каталі­зується певним ферментом, за умов сталості інших показників середовища (фізико-хімічних параметрів, концентрації активаторів та інгібіторів) користуються значен­нями активності ферменту.

Одиниці активності ферментів — умовні величини, що базуються на лінійній залежності швидкості ферментативної реакції від кількості ферменту (або кіль­кості його молекул, що перебувають у каталітичне активному стані).

1. У біохімічній практиці загальноприйнятими є одиниці ферменту. Одиницею ферменту (U— unit; англ.) є така його кількість, яка каталізує перетворення 1 мкмоля субстрату за 1 хв:

1 U= 1 мкмоль/хв.

2. При використанні одиниць системи СІ (SI) активність ферменту виражають в каталах (кат).

1 катал — така кількість ферменту, яка каталізує перетворення 1 моля субстрату за 1 с:

1 кат = 1 моль/с.

3. Розповсюдженою одиницею є питома активність ферменту, яка визнача­ється кількістю одиниць ферментної активності, що припадають на 1 мг білка в біологічному об'єкті (U/мг білка).

У медичній ензимології активність ферменту часто виражають в одиницях (U) на 1 л біологічної рідини, що досліджується, — сироватки крові, слини, сечі тощо (U/л).

3. Молекулярна організація мітохондріального ланцюга біологічного окислення: компоненти ланцюга, їх редокс-потенціали

Система біологічного окислення, що локалізована в мембранах мітохондрій, здійснює дегідрування органічних субстратів та послідовний перенос відновлювальних еквівалентів на кисень через ряд проміжних переносників — транспор­терів електронів та протонів. Ця система організована у вигляді ланцюга електронного транспорту, або дихального ланцюга мітохондрій.

Дихальний ланцюг мітохондрій — сукупність молекулярних компонентів (ферментів та коферментів), які вбудовані в ліпідний матрикс внутрішніх мітохондріальних мембран і здійснюють окислення біологічних субстратів та послі­довне, ступеневе транспортування відновлювальних еквівалентів на кисень з утворенням молекули води.

Компоненти дихального ланцюга мітохондрій:

НАДН-дегідрогеназа — компонент дихального ланцюга, що окислює від­новлений НАД⁺ (НАДН); входить до складу молекулярного комплексу внутрішніх мітохондріальних мембран НАДН-коензим Q-реоуктази.

Сукцинатдегідрогеназа — компонент дихального ланцюга, що окислює янтарну кислоту; входить до складу молекулярного комплексу сукцинат-коензим Q-редуктази.

Коензим Q(убіхінон) — ліпідорозчинний хінон з ізопреноїдним бічним ланцюгом, що містить у тканинах ссавців десять п'ятивуглецевих ізопреноїдних залишків (Q₁₀). Убіхінон виконує функцію колектора відновлювальних еквівалентів, акцентуючи протони та електрони не тільки від ФМН-залежної НАДН-дегідрогенази, а й від ФАД-залежних дегідрогеназ мітохондрій (сукцинатдегідрогенази та дегідрогеназ системи (3-окислення жирних кислот тощо).

Цитохроми мітохондрій: Цитохром Ь. Цитохром с_г Цитохром с. Цитохром а. Цитохром а₃.

Залізо-сіркові білки, що містять негемове залізо (FeS),—це білки, асоційовані з флавопротеїнами мітохондрій (металофлавопротеїнами) та цитохромом b.

Послідовність передавання електронів від одного компонента дихального ланцюга мітохондрій до іншого визначається стандартними окислювально-відновлювальними потенціалами цих компонентів —табл.1.

Таблиця 1. Стандартні окислювально-відновлювальні потенціали компонентів дихального ланцюга мітохондрій

Окремі ферменти та коферменти, що складають дихальний ланцюг, структурно об'єднані між собою в надмолекулярні (мультиензимні) комплекси, інтегровані в ліпідний матрикс внутрішніх мембран мітохондрій, що створює стеричні умови, необхідні для ефективного перебігу окислювально-відновлювальних реакцій.

Комплекси дихального ланцюга внутрішніх мембран мітохондрій

НАДН-коензим Q-редуктаза — ферментний комплекс (являє собою флаво-протеїн, що містить ФМН), який окислює НАДН і передає відновлювальні еквіваленти на коензим Q(убіхінон); у складі НАДН-коензим Q-редуктази НАДН-дегідрогеназа асоційована з FeS-білками (так званий комплекс І).

Сукцинат-коензим Q-редуктаза — ферментний комплекс (ФАД-залежний флавопротеїн), який окислює сукцинат, відновлюючи коензим Q; до складу комп­лексу входить флавопротеїн сукцинатдегідрогеназа, асоційована з FeS-білком (комплекс II).

Коензим Q-цитохром с-редуктаза (убіхінолдегідрогеназа) — ферментний комплекс, що складається з цитохрому b, FeS-білка та цитохрому с_1­;фермент­ний комплекс транспортує електрони з відновленого коензиму Q(QH₂) на цитохром с (комплекс III).

Цитохром с-оксидаза — ферментний комплекс, що складається з цитохромів а та а₃ (комплекс IV); комплекс здійснює кінцеву стадію біологічного окислення — відновлення електронами молекулярного кисню; він містить іони міді, як і інші оксид ази.

Шляхи включення відновлювальних еквівалентів у дихальний ланцюг мітохондрій

1. Включення протонів і електронів у дихальний ланцюг через ФМН флавопротеїну НАДН-коензим Q-редуктази. Цим шляхом на молекулу убіхінону надходять відновлювальні еквіваленти, відщеплені від відповідних субстратів НАДН-залежними дегідрогеназами.

2. Включення протонів і електронів у дихальний ланцюг через ФАД сукцинат-коензим Q-редуктази та деяких інших ФАД-залежних дегідрогеназ. Цим шляхом на убіхінон надходять відновлювальні еквіваленти від янтарної кислоти -метаболіту циклу трикарбонових кислот та певних інших субстратів.

Послідовність включення окремих компонентів системи транспорту електро­нів і протонів у дихальний ланцюг мітохондрій подано на рисунку 1.

Як випливає з наведеної схеми, дихальний ланцюг мітохондрій організований таким чином, що перенос у ньому відновлювальних еквівалентів (електронів) відбувається в напрямку від електронегативного кінця (флавопротеїнів) до електропозитивного цитохрому а_у Більшість метаболітів (субстрати гліколізу, циклу трикарбонових кислот тощо) передає атоми водню в дихальний ланцюг через НАДН-дегідрогеназу (Е-ФМН); сукцинат та КоА-похідні жирних кислот віддають електрони та протони на коензим Qчерез специфічні флавопротеїни (Е-ФАД), минаючи ФМН-залежний флавопротеїн.

Убіхінон є останнім компонентом дихального ланцюга мітохондрій, що здатний транспортувати як електрони, так і протони. На рівні цитохрому bшляхи електронів і протонів розділяються — протони переходять з внутрішньої поверхні мітохондріальної мембрани на зовнішню, а електрони через послідовність цитохромів транспортуються на цитохром а_у який відновлює кисень:

Взаємодія відновленого кисню з вільними протонами мітохондріального матриксу призводить до утворення молекули води:

Рис. 1. Схема організації дихального ланцюга мітохондрій. 1-IV– електронетранспортні комплекси мітохондріальних мембран.

Позначення: -КГ – -кетоглутарат; -ГО-ацил-КоА — -гідроксиацил-КоА; Гл-З-Ф — гліцерол-3-фосфат.